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微量肉汤稀释法测定长裙竹荪多种提取物对食品中常见细菌的抑制效果

作者 :曹奕 发布时间 : 2019-03-16 20:18:51

微量肉汤稀释法是一种抗菌药物药敏性实验的常用方法,原广泛应用于抗生索的最小抑菌浓度MIC测定,以此来监测抗生素的抗药性。近些年来随着食品工业的发展,保鲜、防腐等课题逐渐成为热门,因天然产物普遍具有抑菌话性,在这一领域有着广泛的应用前景,对其抑菌效果的评价也日益重要。目前我国的抑菌效果评估方法主要是牛津杯法和滤纸片扩散法,以抑菌圈的大小来判断抑菌效果。此法难以进行大量样品的快速筛选,且在抑菌物质浓度较低时可能无抑菌圈,不易确定其实际作用效果。

因此,高通量的微量肉汤稀释法现已逐渐得到应用。长裙竹荪是一种真菌,为鬼笔科竹荪属下的一个亚种。国内外学者对长裙竹荪的研究主要集中在化学成分的分离分析与生物活性的研究方面。赵谋明等对共多糖的免疫作用和抗氧化性作了深人研究,而在抑菌活性方面,目前只有对于其乙酸乙酯、正已烷、乙醇、水提取液的相关文献报道。抑菌效果的测定多采用牛津杯法,且主要集中在某一类物质上,供试细菌不够广泛。对不同极性有机溶剂萃取物之间的抑菌活性差异,也未有开展系统性研究的文献报道。实验选取8种食品中常见的细菌作为供试菌种,制备了长裙竹荪的挥发油及三种有机溶剂提取物,通过微量肉汤稀释法结合菌落计数,测定各类物质的最小抑菌浓度CMIC,验证肉汤稀释法的准确性,并对不同提取液的抑苗效果进行比较分析,为后期研究其作用途径和抑菌机理作准备。

1、材料与方法

1.1材料与仪器

长裙竹荪购于福建古田,粉碎30s,过80目筛;无水乙醇、石油醚、正丁醇均为分析纯;无水硫酸钠购自国药集团化学试剂有限公司;胰蛋白胨大豆琼脂ISA,胰蛋白胨大豆肉汤ISB、MRS肉汤、MRS培养基.NaCI、果胶酶均购自北京陆桥有限责任公司;大肠杆菌、肠炎沙门氏菌、单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌、铜绿假单胞菌、荧光假单胞菌购自中科院微生物;植物乳杆菌购自上海市工业微生物研究所。

ESCO Glass II BSC型生物安全柜超净工作台美国Airstream有限公司;QB9006微孔板快速振荡器金坛市医疗仪器厂;THZ-82A气浴恒温振荡器江荪金坛市环宇科学仪器厂;9272型恒温培养箱.上海一恒科技有限公司;SK5200HP超声波清洗机上海科导超声波仪器有限公司、SENCO旋转蒸发仪配有有索氏提取器_上海申生科技有限公司;SB-02多功能粉碎机上海市普但信息科技有限公司;Bio-Tek酶标仪美国伯腾仪器有限公司;Eppendorf离心机5810R美国Eppendorf公司;Milli-Q制水系统美国Millipore公司。

1.2实验方法

1.2.1挥发油与提取物提取挥发油获得:称取长裙竹荪粉末100g装入索氏提取器中,用石油醚作溶剂,加热提取至溶液近无色,蒸馏回收石油醚得浸膏。将所得浸膏进行水蒸气蒸馏,蒸馏至无油滴馏出,经油水分离、无水硫酸钠千燥后获得产物。

乙醇提取物获得:按韩慧’等方法处理获得产物;石油醚提取物获得:按檀东飞*等方法处理获得产物;正丁醇提取物获得:100g长裙竹荪70%乙醇300mL没泡12h,于86C用正丁醉萃取,水浴加热回流提取2h,旋蒸至无正丁醇”。所得挥发袖初始浓度为250mg/mL,三种有机溶剂提取浸膏经济解后初始浓度均为2500mg/mL。
1.2.2抑菌实验

1.2.2.1受试菌推备,将受试菌种接人固体培养基活化一代,勾一;环单菌落于新鮮TSB液中37C培养6-8h,使其菌数达到10"CFU/mL。

1.2.2.2肉汤稀释法阴性对照:200pLTSB。

对照组1:倍比稀释的提取液,取10个梯度晖发油为250.00、125.00.62.50.31.20、15.60.7.80、3.90、1.95.0.98、0.49mg/mL,三种有机溶剂提取物为:

2500.0、I250.0.625.0.312.0、156.0、78.0.39.0.19.5.9.8.4.9mg/mL)每个梯度为100μL.+TSB100μL

对照组2:10'CFU/mL的菌液100μl+TSB100μl.

实验组:10^CFU/mL的菌液100ul+倍比稀释的提取液100μL

加样开始前涂布平板确认初始菌液浓度,放入37C培养箱中培养12h,观察各孔,以肉眼无菌生长的最低浓度孔为MICtg/mL),辅以对不同浓度的提取液处理过后的菌液除布平板,进行菌落计数,验证结果。

1.2.3数据处理

实验数据均为3次平行实验的平均值,数据用EXCEL进行处理,平均值间的差异显著性通过统计软件SPSS17.0进行了检验。

四类长裙竹荪提取物不同浓度下对八种细菌生长的影响

四类长裙竹荪提取物不同浓度下对八种细菌生长的影响

2、结果与分析

2.1抑菌效果测定

通过徐布平板,得出了不同提取液处理过后各类菌液中的总菌数即表1),同时通过浊度判断得出了微量肉汤稀释法测定的MIC值即表2)。

竹荪抑菌效果测定结果

竹荪抑菌效果测定结果

由表1与表2的结果比较,可看出采用微量肉汤稀释法得到的32项结果中,有29项与平板计数的测定结果相符,符合率达90.7%。出现差异的3项结果分别是:长裙竹荪的挥发油对金黄色蔺萄球菌的MIC;石油醚提取物对肠炎沙门氏苗的MIC;正丁醇提取物对单增李斯特菌的MIC。而在表2所得的最小抑菌浓度下,其菌落总数分别为7.15+0.39.6.47士土0.10.6.36+0.121gCFU/mL,菌数略有增长,大大低于正常生长情况,亦表现出抑制细菌生长的效果。同时,菌落总数的测定结果虽然精确,但仍受许多环境因素的影响。因此,微最肉汤稀释法在操作简便快捷的同时,仍能保持高准确性。2.2各类提取物的抑菌效果比较

由表1与表2可得:长裙竹荪的各类提取物中,挥发油的广谱抑菌效果最好,其与三种有机溶剂提取物的差异均极显著βp<0.01)见表3)。

各类长裙竹荪提取液抑菌效果显著性分析

各类长裙竹荪提取液抑菌效果显著性分析

三种有机溶剂提取物之间的差异并不明显如值分别为0.378、0.596与0.723)。在提取物对各类供试细苗的抑制效果比较过程中,长裙竹荪挥发油对铜绿假单抱苗表现出极好的抑制效果;乙醇提取液对单增李斯特苗和铜绿假单抱菌的抑制效果最佳69.0mg/mL);石袖醚提取物和正丁醇提取物对单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌的抑菌效果最显著69.0mg/mL)。乙醇提取物和石油醚提取物对植物乳杆菌的抑制效果最差456.0与312.0mg/mL)。

3、结论

3.1郝景雯等采用滤纸片扩散法对长裙竹荪乙醇提取液抑菌作用进行了研究,但其只是单纯地证明了醇提物具有抑菌作用,且未给出其最小抑苗浓度。实验采用了新方法微量肉汤稀释法,辅以平板涂布验证结果,不仅证明了该法具有高准确性,还给出了多类提取物对8种细菌的最小抑菌浓度,天然抑菌剂的定性定量研究方面都取得了较大进展。微量肉汤稀释法以其简便快速、高效等特点,体现出其优越性。

3.2实验结果还发现长裙竹荪的挥发油具有很好的抑苗效果,其主要成分经黄明泉等分析得到:主要包含醛、酮、酚、烃、酯以及含硫化合物,其中多种成分均有文献证明具有抑菌功能。而这些成分对于革兰氏阳性苗和阴性苗的抑制效果并不一致,成分间的协同和拮抗作用更加复杂,这也能在一定程度上解释挥发油对阳性菌和阴性菌的抑制效果并无明显差别"。三种有机溶剂的极性大小分别为乙醇>正丁醇>石油醚。研究中还发现随着抑菌剂极性的减弱,提取物对单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌等革兰氏阳性笛的抑制效果增强,对革兰氏阴性菌的抑制效果无显著变化。这提供了一.种可能性,即长裙竹荪抑制革兰氏阳性菌的成分主要是非极性的。这一结论正确与否,尚待解答。提取物对植物乳杆菌的抑苗效果不佳,可能是因其属于兼性厌氧菌,其生长机制与其他供试菌存在差别。

3.3单增李斯特菌是-种在食品工业中危害很广的食源性致病苗”,长期以来难以寻找到一种有效的杀灭方法。本实验发现了长裙竹荪的四类提取物都对其有很好的抑制效果MIC<40.0mg/mL),为长裙竹荪开发成为特异性的抗菌物质提供了广阔前景。虽然采用微量肉汤稀释法比较快速的得出一些结论,并初步验证了其的正确性。然而,如前所述,其具体抑苗成分和抑苗机理仍不明朗。所以在下一步的研究中,课题组拟通过透射电子显微镜CEM)观察长裙竹荪对具体细菌的作用途径,通过荧光定量PCR.SDS-PAGE等方法观察其对细菌生长相关蛋白的表达变化影响。

 

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